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经典案例

全基因组重测序探索刚地弓形虫致病基因

Variation detection based on next-generation sequencing
of type Chinese 1strains of Toxoplasma gondii with
different virulence from China

期刊:BMC Genomics
影响因子:3.986
发表单位:安徽医科大学、诺禾致源
发表年份:2015年10月

一、研究背景

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii Nicolle&Manceaux, 1908)寄生于人和许多种动物的有核细胞,但只能在猫科动物的肠道内繁衍,能够引起人畜共患的弓形虫病。与北美和欧洲群体遗传结构不同,Chinese 1 (ToxoDB#9)是中国的弓形虫优势基因型。在Chinese 1型弓形虫中,Wh3(强毒株)和Wh6(弱毒株)对小鼠表现出了不同的毒力。本研究拟通过全基因组重测序技术,从基因组水平探究两种虫株表型及致病性差异的原因。

二、方法流程

取材

强毒株Wh3虫株
弱毒株Wh6虫株

建库

构建500 bp文库

测序

1. 利用HiSeq 2000,    PE100测序平台
2. 测序深度:
Wh3为63.91X;Wh6为63.61X

分析

1. SNP、indel、CNV、SV的
    检测及注释
2. 毒力相关因子的信息分析
3. qRT-PCR分析

三、研究结果

1. SNP、indel检测及注释

与参考基因组比对发现:Wh3中共有505,856个SNPs,30,004个indels;Wh6中共有505,654个SNPs,30,658个indels。进一步分析两样本特有变异,发现Wh3中特有SNP和indels分别位于2,847和2,452个基因中,Wh6中特有SNP和indels分别位于2,868和2,613个基因中。

2. CNV、SV检测及注释

与参考基因组比对发现:Wh3中共有2,320个SVs,1,942个CNVs;Wh6中共有4,661个SVs,3,080个CNVs。其中,Wh3含有85个片段插入(总长度:282,700 bp),2,995个片段缺失(总长度:4,940,000 bp);而Wh6含有90个片段插入(总长度:328,800 bp),1,852个片段缺失(总长度:7,157,700 bp)。

3. 毒力相关因子的变异信息分析

通过对与弓形虫毒力和侵染性相关的一系列关键因子(ROPs、GRAs、MICs、RONs和SAGs)的变异信息分析,发现与其他影响因子相比,GRA3和RON3的编码基因中含有更多的SNPs和indels;其中:GRA3编码基因含有35个SNPs和2个indels,RON3编码基因含有89个SNPs和6个indels。
另一有趣发现是,与I、II和III型弓形虫相比,Chinese 1型弓形虫的ROP16和GRA15表现为多态性的ROP16I/III和GRA15II。

4. qRT-PCR分析

为发现与Wh3和Wh6表型差异相关的基因,分别对Wh3、Wh6和RH这三种虫株进行qRT-PCR分析。与强毒株Wh3相比,发现在弱毒株Wh6中,GRA3和RON3的基因表达量显著上调,而ROM4, profilin, M2AP, AMA1, RON2, RON3和RON4的基因表达量显著下调。与参考基因组虫株RH相比,发现在Wh3和Wh6中,SRS9, ROP8, MIC8和RON5的基因表达量均上调,而SAG1, ROP5和ROP18的基因表达量均下调。

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四、研究结论

通过对Wh3和Wh6两种虫株的全基因组重测序分析,发现与I型弓形虫参考基因组相比,Chinese 1型弓形虫中出现了大量的基因组结构变异。重测序及qRT-PCR分析,发现有26个影响因子表现出显著差异,推测它们与弓形虫表型及致病性差异相关。

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