单细胞转录组测序

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经典案例

案例一 单细胞转录组测序研究人类着床前胚胎细胞及胚胎干细胞

Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem

期刊:Nature Structural & Molecular Biology
影响因子:11.633
发表单位:北京大学
发表年份:2013年8月

一、研究背景

运用单细胞转录组测序技术,研究了处于7个发育阶段的124个人类着床前胚胎细胞及胚胎干细胞的基因表达情况。

二、方法流程

取材

1. 选取卵母细胞、受精卵、2细胞
    胚、4细胞胚、8细胞胚、桑葚胚
    等着床前的胚,用显微吸取法
    分离得到单细胞;
2. 每组设3~30个生物学重复。

建库

1. 单细胞cDNA 扩增;
2. Illumina Truseq DNA
    preparation Kit构建测序文库。

测序

1. Illumina HiSeq 2000 PE100;
2. 每个样本20~60 M clean reads,
    124个样本共产出438 Gb data。

分析

1. 与参考基因组比对
2. 基因表达分析
3. 可变剪切分析
4. lncRNA筛选及表达分析
5. 基因差异表达分析

三、研究结果

1. 基因表达分析

在90个胚胎细胞中,平均有 11,006个基因和18,022个转录本表达,分别占22,092个已知基因和36,983个已知转录本的49%和48%。

2. 可变剪切分析

平均有4,822个基因至少含有2个已知的可变剪切isoforms,981个基因含有2个以上的可变剪切isoforms,最多可达7个 isoforms。

3. lncRNA表达分析

在90个胚胎细胞中,共检测到18,383个lncRNA,平均每类细胞表达3,337个,分别占28,640个已知lncRNA的64%和11%。lncRNA可调控胚胎发育过程。

4. EPI与hESC转录组比较

人类外胚层细胞EPI与人类胚胎干细胞hESC在转录水平上差异巨大,两种细胞间共检测到1,498个差异基因。

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四、研究结论

通过单细胞转录组测序技术,对处于7个发育时期的90个人类胚胎细胞及34个由胚囊分化而来的人类胚胎干细胞进行了研究,发现了不同发育阶段及不同细胞特异表达的基因及lncRNA,为解析人类早期胚胎发育的分子调控机制及鉴定人类胚胎干细胞的多能性和分子特征奠定基础。

案例二 单细胞转录组测序揭示人CD127+先天淋巴细胞的异质性

The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells
revealed by single-cell RNA sequencing

期刊:Nature Immunology
影响因子:24.973
发表单位:瑞典卡罗林斯卡学院
发表年份:2016年2月

一、研究背景

先天淋巴细胞(ILCs)是一种免疫细胞,它通过释放可溶性的因素调节对病毒、细菌和寄生虫的早期免疫反应。这些细胞可以根据细胞表面的转录因子及细胞因子被分为三个亚型,每种亚型都有不同的功能。

二、方法流程

取材

用流式细胞仪分选患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者的扁桃体组织中的ILCs(LinCD127+)和NK cells(CD45+Lin−CD127 NKG2A+CD56+CD16 ) 。

建库

1. Smart-seq2进行单细胞扩增;
2. Nextera XT DNA Sample
    Preparation Index Kit构建
    文库。

测序

Illumina HiSeq 2000
3×106reads /样本

分析

1. 质控、数据筛选;
2. 序列比对、基因表达分析及标准
    化处理;
3. t-SNE细胞分型分析;
4. SCDE基因差异表达分析。

三、研究结果

1. 细胞分型分析

采用PCA(主成分分析)和t-SNE对ILC中847个表达的基因进行分型分析,将细胞分为4类:ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。

2. SCDE基因差异表达分析

应用SCDE软件包对4类细胞的差异基因进行分析,找出共有及特有差异基因,结果发现,CD127+ILCs中共有的差异基因的表达量比NK细胞中明显要高。

3. ILC1、ILC2、ILC3差异基因表达分析

结果表明,ILC1 cells共有79个上调表达基因,参与干扰素γ的调控,ILC2 cells共有58个上调表达的基因,在前列腺素、Notch信号通路及环境感应中发挥作用,ILC3 cells共有371个上调表达的基因,根据GO注释有85个与免疫相关,且存在未知功能的基因。

4. ILC3细胞亚型分析

采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958个注释的免疫基因,将ILC3分为3个亚型:Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通过对这3种亚型细胞的分析,发现了新的免疫细胞CD62L+ ILC3。

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四、研究结论

本研究通过对648个单细胞进行单细胞转录组的分析,应用t-SNE细胞分型、SCDE基因差异表达分析,在ILC3中发现新的免疫细胞CD62L+ ILC3。