蛋白质修饰组学

磷酸化乙酰化泛素化糖基化技术参数结果展示经典案例


经典案例

磷酸化蛋白质组揭示昼夜节律调控机制

Phosphorylation Is a Central Mechanism for Circadian Control of Metabolism and Physiology

研究对象:小鼠肝脏
期 刊:Cell Metabolism
影响因子:18.164
发表单位:马克斯普朗克研究所
发表时间:2017年1月

一、研究背景

生物钟,作为生物体内一种无形的时钟,控制着生物体内几乎全部的代谢过程,并且其自身会不断优化以保证生物体的稳态和代谢健康。生物钟节律的紊乱会导致一系列的疾病,如糖尿 病、肥胖和代谢疾病。研究生物钟,在医学上有着重要的意义,并对生物学的基础理论研究起着促进作用。许多研究已经利用转录组和蛋白质组技术研究了昼夜节律,但是磷酸化蛋白质 组尚未涉及。

二、研究策略

取样策略

小鼠肝脏组织,两天之中每3小时取样一 次,每组4个生物学重复

质谱策略

磷酸化蛋白质组 TiO2富集,
Label-free定量技术,
Q Exactive HF质谱检测,
MaxQuant 搜库

后续验证

转录激活分析
Western Blotting 验证

三、研究结果

1. 体内大规模昼夜磷酸化蛋白质组

小鼠肝脏组织中共鉴定到20,404个磷 酸化肽段,20,076个磷酸化位点, 4,461个磷酸化蛋白,且定量重复性 较高。

2. 小鼠肝脏磷酸表达水平每天大幅度振荡

其中27%的磷酸化肽段,41%的磷酸化蛋白表达水平 在2天内发生大幅度变化(图1A)。表达水平聚类分 析,可以将磷酸化肽段分为光照和黑暗两大类(图 1B)。PCA分析表明,磷酸化蛋白质组循环周期为一 天(图1C)。肝脏磷酸化蛋白质富集到不同代谢通 路,表明翻译后修饰在昼夜节律调控中起着关键作用 (图1 D)。
蛋白质表达量和磷酸化蛋白表达量均随昼夜节律振 荡,但是磷酸化蛋白质表达量振荡幅度更大(图 2A,图2B)。蛋白质表达水平平均差异倍数为1.2, 磷酸化蛋白质表达水平平均差异倍数为5倍(图 2C)。FC值累计曲线表明,80%的磷酸化累积强度 来自于20%的磷酸化水平振荡的肽段,表明磷酸化水 平变化的蛋白为调控蛋白而非结构蛋白(图2D)。

3. CLOCK蛋白上氨基酸位点的磷酸化循环

小鼠肝脏中CRY1 S588和CRY2 S557分别在 CT0和CT21表达量达到峰值(图3A)。在 CLOCK蛋白上发现了新的磷酸化位点S446和 S440/441,其磷酸化水平也出现周期性的变 化(图3B),这些氨基酸残基位于蛋白质序 列中富含丝氨酸的区域,在哺乳动物中高度保 守(图3C)。CLOCK磷酸化突变体转录活性 低于野生型,然而CRY1介导的转录抑制不受 影响(图3D,图3E)。结果表明,CLOCK蛋 白上的S440 / S441和S446的体内磷酸化循环 在不含CRY1介导的抑制的情况下即可调节其 转录活性。

4. 昼夜节律中小鼠肝脏激酶活性调控

激酶富集分析结果表明,ERK底物和AK- T/mTOR底物磷酸化水平在白天和晚上分 别达到峰值(图4A)。与 EGFR-RAS-ERK-RSK级联反应相关的激酶 磷酸化水平在白天达到峰值,这些酶多为 糖酵解,糖原合成和脂肪合成的限速酶, 使得小鼠在食物摄入最少的时候促进糖酵 解提供能量,抑制糖原和脂肪的合成。与 insulin-AKT-mTOR 级联反应相关酶的磷 酸化水平在夜晚达到峰值,此时小鼠活动 活跃,营养充足,使得脂肪合成、生长相 关的代谢途径比较旺盛(图4 B)。