Hi-C测序

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经典案例

案例一 Hi-C技术揭示CTCF位点分化与染色质结构域进化相关

Comparative Hi-C Reveals that CTCF Underlies Evolution
of Chromosomal Domain Architecture

期刊:Cell reports
影响因子:8.358
发表单位: Cancer Institute, University College London
发表年份:2015年3月

一、研究背景

CTCF(CCCTC-binding factor)是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子,又名11锌指蛋白,与绝缘子(真核生物基因组的调控元件之一,功能为阻止临近调控元件,对它所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用)的活性密切相关。人类基因组有将近一万五千个CTCF绝缘体位点,说明CTCF在基因调控方面的功能非常广泛。2015年3月,VietriRudan等报道了利用Hi-C技术研究揭示CTCF具有促进基因组结构变化的重要作用。这项研究比较了四种哺乳动物的CTCF作用位点,呈现了绝缘子位点分化与染色质结构域的进化存在直接联系,该成果发表于Cell Reports(IF=8.358)上,为转录因子的研究提供了新的思路与方法。

二、方法流程

取材

小鼠、兔子、猴子、狗的肝细胞,每个物种的细胞量达到1~5X107个

建库

1. 甲醛固定
2. HindIII酶切
3. 末端修复,加生物素
4. 连接酶连接
5. 提取DNA
6. 磁柱纯化

测序

利用HindIII进行酶切,PE75测序,测序平台为Illumina HiSeq

分析

1. CTCF结合位点分析
2. CTCF的进化动态与染色体的
    拓扑结构域的相关性
3. 通过Hi-C数据比较染色体拓
    扑结构域
4. CTCF结合的变异驱动染色体
    结构的变异

三、研究结果

1. CTCF作用机制

CTCF和粘连蛋白通过形成稳定的染色质环对基因发挥作用,这种CTCF/粘连蛋白锚定的环状结构广泛分布于基因组上,不仅包括标定拓扑结构域边界的环状结构,而且包含存在于这些结构域中的环状结构。

2. 序列变异驱动CTCF结合变异

CTCF识别并结合特异的核酸序列,小鼠、狗和猕猴中CTCF ChIP-seq表明CTCF强结合的染色质区域序列比较保守。而序列的变异导致CTCF能力的改变,并最终影响CTCF的结合。这些结果表明序列的变异驱动了CTCF结合的变异。

3. CTCF的进化动态与染色体的拓扑结构域的相关性

小鼠肝细胞的Hi-C数据表明保守的CTCF位点倾向于染色体结构域的边界,而物种特异的CTCF位点倾向于染色体结构域内部。这表明CTCF的进化动态与染色体的拓扑结构域是相关的。

4. 通过Hi-C数据比较染色体拓扑结构域

鼠、猕猴、狗、兔中Hi-C数据表明它们的拓扑结构域具有相似性,它们的差别主要在拓扑结构域内部。比较狗与小鼠的染色体拓扑结构发现那些保守的结构域比不保守的结构域要小一些。

5. CTCF结合的变异驱动染色体结构变异

CTCF结合与否改变了染色体结构域内部的结构,而更大尺度上的结构域则不受CTCF结合改变的影响。那些部分保守的CTCF位点(比如在小鼠和狗中存在而在猕猴中不存在),当不存在时绝缘子效应降低。这表明,CTCF结合的变异驱动了染色体结构的变异。

6. 不同的拓扑结构域之间彼此存在联系

在鼠和狗保守的CTCF位点中有94%在方向上也是保守的,这表明CTCF位点具有方向性。另外不同的拓扑结构域之间彼此存在联系。

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四、研究结论

CTCF识别并结合特异的核酸序列,小鼠、狗和猕猴中CTCF ChIP-seq表明CTCF强结合的染色质区域序列比较保守。CTCF结合与否改变了染色体结构域内部的结构,而更大尺度上的结构域则不受CTCF结合改变的影响。

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案例二 利用临位连接技术和高通量测序技术
构建全基因组单倍型图谱

Whole-genome haplotype reconstruction using proximity-ligation
and shotgun sequencing

期刊:Nature biotechnology
影响因子:41.514
发表单位: Ludwig Institute for Cancer Research
发表年份:2013年11月

一、研究背景

将高通量测序技术和临位连接技术相结合,利用临位连接技术将变异信息连接到一个单体型中。因此实验如何恢复和保持DNA的空间结构成为难点。基于临位连接技术,利用30×数据可以准确的(99.5%)重建杂交小鼠细胞中涵盖95%等位基因的染色体跨度的单倍型。另外,由于人类基因组存在低密度变异,在17×数据的条件下,我们利用HaploSeq 和LCP法获得了涵盖染色体81%长度的单体型和98%的准确性。

二、方法流程

取材

1. 小鼠胚胎干细胞F123细胞系
2. 人类GM12878细胞系

建库

1. 甲醛固定
2. HindIII酶切
3. 末端修复,加生物素
4. 连接酶连接
5. 提取DNA
6. 磁柱纯化

测序

PE75

分析

1. 小鼠染色体跨度单体型构建
2. 人类染色体跨度单体型构建

三、研究结果

1. 染色体内和染色体间的reads分布

使用GATK进行变异检测,并进行分型。用HapCUT进行定位,小鼠的基因组上大约22%的reads为染色体间相互作用,人的基因组上大约55%的reads为染色体间相互作用。

2. HaploSeq实验策略

研究者发现CAST和J129(小鼠胚胎干细胞来源亲本)中大部分的互作信息为染色体内互作,而染色体间互作关系较少,这种现象被称为染色体疆域。同时,Hi-C的结果表现出更多的是顺式调控作用,反式调控作用只占到很小的比例。

3. 小鼠胚胎干细胞生成单体型

使用HapCUT软件进行单体型分析,使用小鼠Hi-C实验中成对的reads进行单体型判断,并与已知的亲本CAST和J129来进行验证。研究者采用不同的建库方式进行单体型构建,结果表明只要有Proximity ligation(临位连接技术)就能对单体型图谱的长度和饱和度均有质的提升。

4. 人类个体单体型分析

研究者利用公用的1,000个人的GM12878基因组全基因组重测序数据,进行染色体跨度单体型构建。利用haploseq分析,获得了人类完整的单体型图谱,包括X染色体,其分辨率达到22%。与已公布的人类单体型数据进行比较,其准确度高达98%。

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四、研究结论

研究者发现CAST和J129(小鼠胚胎干细胞来源亲本)中大部分的互作信息为染色体内互作,而染色体间互作关系较少,这种现象被称为染色体疆域。同时研究也表明表明,每个等位基因占有不同染色体区域,染色体间的互动频率在小于2%。利用haploseq分析,获得了人类完整的单体型图谱,包括X染色体,其分辨率达到22%,准确度达到98%。

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