遗传图谱

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经典案例

单细胞全基因组测序探索精子重组规律和遗传缺陷

Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells
by Whole-Genome Sequencing

期刊:Science
影响因子:29.35
发表单位:北京大学、诺禾致源
发表年份:2012年12月

一、研究背景

减数分裂期间同源染色体之间发生的片段交叉重组(crossover),对于实现遗传物质的分离是至关重要的,也是产生生物基因组多态性的重要机制。重组率在整个基因组中并非均匀分布,而是集中在一些散布的狭小区域内(hotspot),并且不同物种之间以及相同物种的不同个体之间都可能存在明显的差别。

以往对于人类染色体重组的研究,受限于实验技术的限制,分辨率一直都比较低;另外,由于一个家庭内的孩子数目有限,以往的研究都是在群体水平上开展的,而无法开展个人水平的遗传重组规律研究。

单细胞DNA扩增技术和高通量测序技术的发明,使得测序单个精子的基因组成为可能。利用精子基因组测序技术来研究人类的染色体重组规律,具有以往技术无法比拟的优势。首先,精子是天然重组产生的单倍体,取材方便,而且从一个人可取的精子数量几乎是无限的,可以很容易地研究个人水平的重组分布规律;其次,全基因组测序技术提供了最高的分子标记(marker)密度,能够得到最为精确的crossover定位结果,测序技术本身具有高通量、自动化等特点,随着测序成本的迅速降低,这一优势以后会更加突出。

二、方法流程

取材

1. 一名亚洲男性捐献者体细胞;
2. 捐献者父母体细胞;
3. 99个精子。

建库

1. 从捐献者及其父母的血液中
    提取10mgDNA,进行二倍
    体基因组建库测序。
2. 精子采用多重退火循环扩增
    技术(MALBAC)进行单细
    胞全基因组DNA扩增。

测序

1. Hiseq 2000测序;
2. 二倍体测序:捐献者及其父
    母;父母体细胞测序1X;捐
    献者体细胞测序深度70X;
3. 93个精细胞1X,6个精细胞
    5X。

分析

1. 比对参考基因组
2. 检测单体型重组交换点
3. 重组位点分析
4. 与已发布单体型图谱比较
5. 异常染色体重组分析

三、研究结果

1. 单细胞测序

对一名亚洲男性捐献者的93个精子和6个精子分别进行1X、5X单细胞全基因组测序,基因组覆盖度分别为23%和43%。99个精细胞样品中3个非单倍体细胞被过滤掉以免影响后续的分析。单精子细胞中约89%的reads比对到人类染色体基因组上,与典型的人类基因组重测序一致。

2. 捐献者体细胞SNP检测

对捐献者体细胞进行二倍体基因组测序,测序深度70X,鉴定出约2.8×106个SNP位点,其中1.4×106个SNP位点是杂合位点。在这些杂合位点中,高深度(5×)测序时约有500,000(35%)个SNP准确性达到99%,低深度(1×)测序时约有300,000(20%)个SNP准确性达到99%。

3. 捐献者单体型确定

通过比较所有精子样本基因分型信息,将体细胞杂合SNP进行染色体水平的单体型分型。共完成约1.1×106(约82%)的杂合SNP分型。同时,对捐献者父母进行10X深度测序,通过双亲基因型使用家系信息评估了单体型准确性,两种方法分型一致性达99.5%。

4. 推断每个精子中交换发生的位置

通过隐马尔可夫模型(HMM)精确推断了交换发生的位点。总共鉴定出2,368个发生在精细胞中的交换位点。平均每个精细胞约26个交换位点。与之前家系研究方法报道的结果一致。

5.重组位点与转录起始位点关系

前人研究表明,以人群体研究得到的重组率在靠近基因TSS的区域(≤20Kb)较低;在远离基因TSS的区域(≥20Kb)较高;本研究以个人重组率研究,所得结论与群体重组率分布基本一致;说明近TSS区域重组率降低是由分子机制决定而非自然选择的结果。

6.染色体异常分析

研究发现5%的精子(4个)染色体数目发生异常,即染色体组非整倍型。其中S39精子的19号染色体发生了缺失,S65精子的6号染色体发生了二倍化。染色体异常比例与人精母细胞影像学研究结果一致。

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四、研究结论

本研究采用最新发明的多次退火循环扩增技术(MALBAC),对一名亚洲男性及其99个精子进行了单细胞全基因组测序,这项工作首次实现了高覆盖度的单个精子的全基因组测序,构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱,并且解决了一个困绕学术界多年的问题,即基因区附近重组率的降低是由于分子机制而非自然选择造成的。

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