诺禾致源

如何保证组装结果的可靠性？

对于组装的结果，除了保证Contig N50和Scaffold N50两项指标外，还需要对组装质量进行评估。如利用EST数据和RNA数据进行完整性评估，即评估组装出来的基因的完整性；利用BAC数据检验是否有装断或装错的情况，以及利用保守基因评估（CEGAM评估／BUSCO评估）基因组组装的完整性。

为什么高重复和高杂合基因组不好拼接，我们的基本解决策略，周期和指标？

高重复基因组特点：重复序列的比例很高，长度较长，很难连接成较长的序列，在构建de Brujin图时， 会出现右图所示的情况：

在化简de Brujin图时，若随机选择重复序列进行连接比如A-E-D,A-E-B可能会导致连接错误。若不进行随机选取，在分叉位点将序列截断，会造成contig长度太短，无法进行后续组装。

对于二倍体杂合基因组，组装一般只组装一套染色体出来，那么对于序列中的杂合位点，如下图所示，如何区分杂合部分和纯合部分，并且确定哪些杂合部分属于同一套基因序列是杂合基因的组装难点。

诺禾致源 de novo 团队针对复杂基因组（高重复或高杂合）开发了多种组装策略，包括纯二代，二加三，纯三代等，并搭配新技术，成功解决了高重复或高杂合基因组的组装困难情况。此外，针对超高杂合的基因组，自主研发了NovoHeter软件，极大的缩短的组装的周期和成本。具体策略及组装指标见前文介绍。

小片段和大片段的DNA样品是否需要是一样的？

（Survey和基因组 de novo 所用DNA是否需要一样的？）

原则上进行 Survey 和 de novo 使用的 DNA 是来自一个个体的。如果DNA量不足以满足整个de novo项目，则建议小片段文库的DNA必须来自同一个体，大片段文库使用同一群体的另一个个体。

若样品提取困难，样品量不足，有什么办法可以解决？

若老师那边样品提取困难或者样品量不足，有以下几种策略：

1. 小片段采用一个个体，大片段库采用同一群体的另一个个体；

2. 若一个个体的样品量不足建小片段库，可以将一个世系的样品混样进行提取；

3. 可以通过全基因组扩增技术，只需要少量的全基因组DNA，经过特殊的扩增过程，对扩增产物进行文库构建。但是全基因组扩增的缺点是对于污染部分有偏好性，若污染序列较多，扩增会增加污染的比例。

样品有污染对后续组装有多大的影响？

样品污染对后续组装及分析都有较大的影响，会提高组装难度，可以通过Survey分析对样品中的污染进行初步评估，在组装过程中将目标物种和污染序列分开。

怎样评估研究物种的基因组大小？

1. 网站查询

查询植物基因组大小的网站：http://data.kew.org/cvalues

查询动物基因组大小的网站：http://www.genomesize.com

2. 流式细胞仪方法

流式细胞仪是目前比较常用的估计基因组大小的实验方法。可以老师自己做流式评估，也可以我们帮助老师联系相关公司去做。

3. Survey评估

Survey分析，即将测序得到的reads打断成K-mer，通过K-mer分析，从数学的角度评估基因组的大小，杂合以及重复等信息。并进行初步组装，从初步组装的Contig的GC分布图上，判断该物种是否有污染等信息，从而为后续组装策略的制定提供可靠的依据。