全长转录组

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经典案例

利用单分子实时测序研究高粱转录组

A survey of the sorghum transcriptome using single-molecule long reads

期刊:Nature Communications
影响因子:11.329
发表单位:科罗拉多州立大学
发表年份:2016年

一、研究背景

高粱是世界上非常重要的C4作物,也是重要的耐胁迫的谷类,重要的研究非生物胁迫的模式生物。本研究以高粱为研究材料,采用Pacbio的Iso-Seq策略,调研高粱转录组特征,改进高粱基因集注释。

二、方法流程

取材

干旱胁迫处理的
高粱种子(BTx623)和对照

建库

Pacbio Iso-Seq文库1-2、2-6kb
Illumina文库作为后续对照分析

测序

Pacbio RS II

分析

1. TAPIS流程搭建
2.可变剪接事件分析
3.多聚腺苷酸化事件(APA)分析
4.新基因发现
5.差异表达分析

三、研究结果

1. AS事件分析

本研究发现,有10,053个isoform经历了AS事件,其中只有2,950个isoform和现有的基因模型吻合。Pacbio数据结果证实高粱转录组AS事件比之前的认知更为普遍。同时,文章对在Pacbio中的多isoform的基因做了RT-PCR验证,证实了结果的可靠性。

2. APA事件分析

APA事件是在编码区或3’-UTR区形成isoform,提高转录本的复杂性。由于单分子测序技术利用Oligo dT引物合成cDNA,poly(A)会出现在测序结果中。因此,单分子测序技术是研究APA的有力工具。本文发现在已表达的14,550个基因中,11,013个至少有1个poly(A)位点。

3. 新基因发现

原来的参考基因集有~34,500个基因。在该研究中预测到2171个可能的新基因。为了鉴定这些新基因是否在其他物种中存在,我们使用BLAST中的tblastx和blastx分别比对到收集的植物cDNA序列和Swiss-Prot蛋白数据库,共检测到971个基因。为了证明这些新基因的表达,随机选择7个基因并用RT-PCR验证,证实了新基因的表达和剪切。

图 Iso-seq和已注释的不同可变剪切类型的比较

四、研究结论

采用Pacbio Iso-Seq方法,对高粱的转录组认知达到空前的高度。

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