PCR产物脱靶检测

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经典案例

用CRISPR-Cas9技术编辑蚊子基因组

Genome Engineering with CRISPR-Cas9 in the Mosquito Aedes aegypti

期刊:cell reports
影响因子:8.28
发表单位:Howard Hughes Medical Institute
发表年份:2015.3

一、研究背景

蚊子是登革热病毒等的潜在传播载体,据报道每年蚊子可以感染成千上百人发烧、关节疼痛等,甚至导致50000人死亡。之前研究者采用ZEN,TALEN,或者同源重组技术可以使蚊子特异 性位点产生基因突变,但是编辑效率不高,本研究采用CRISPR/Cas9技术编辑蚊子基因组,探讨和研究有效的编辑浓度、质量,稳定表达突变位点细胞系。

二、方法流程

取样

在蚊子胚胎发育期注射sgRNA和Cas9,对636只蚊子个体进行提取基因组DNA

方法

PCR产物测序,Illumina MiSeq

分析

1、靶点附近每个位点变异情况和编辑效率;
2、同一个基因设计3个不同的靶位点,筛选出编辑效率最高的sgRNA;
3、插入一个外源序列统计出脱靶效率和靶位点变异情况。

三、研究结果

在进行基因编辑636只蚊子中,有61只存活(9.6%),发生插入和缺失的概率是24.57%。图c进行三次独立重复实验,靶位点编辑位置一致,在靠近PAM区第3-4个碱基处编辑效率最高。