预期用途

本产品用于定性检测孕周为12-24周的单胎孕妇外周血血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸(DNA)。通过分析样本中胎儿游离DNA的21号、18号及13号染色体数量的差异,对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行产前辅助判断。

染色体异常是引起流产和新生儿死亡的常见原因,其中21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华氏综合征)和13-三体(帕陶氏综合征)是最为常见的染色体数目异常,发病率分别为1/800~1/600、1/7000~1/3500和1/6000~1/5000。21-三体可导致智力低下、心脏病和其他先天性畸形,18-三体和13-三体导致多发先天性畸形和早期新生儿的死亡。对这类疾病目前尚无有效的治疗措施,此类患儿的出生给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。因此产前早期诊断对家庭具有重大的意义。 针对染色体疾病的产前检测主要以血清学筛查、羊水穿刺为主。但血清学筛查准确度较低,具有5%的假阳性率及20-40%漏诊率;羊水穿刺虽然准确度较高,但是对孕妇具有创伤性,有1%的流产风险,不便于大规模的产前检测。本试剂盒通过高通量测序技术,直接对孕妇外周血中的胎儿游离DNA进行检测,能够快速对21-三体、18-三体和13-三体综合征进行无创的产前辅助检测。

检验原理

本试剂盒就是基于高通量测序基本原理,在孕妇血浆中的微量的游离DNA片段两端加上通用的测序接头,构建好可以用于测序的测序文库。利用Next seq 550 NG高通量测序系统通过文库上的测序接头与测序芯片内部进行杂交固定,测序中加入不同荧光标记的可逆终止的脱氧核糖核酸,测序仪收集荧光信号完成被测目标片段的基因序列的读取。将这些已测的reads序列比对到参考基因组的各个染色体上,通过大样本量的统计归一化后,常染色体上的reads数满足正态分布,之后采用Z检验检测方法差异发生的概率,从而比较两个平均数的差异是否显著。当胎儿DNA含量达到一定浓度,如13,18或21-三体,则对应染色体上的reads数占整个基因组的比例值会与正常胎儿的这一比例值存在显著差异。通过高通量测序技术和生物信息学数据分析实现了对21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体的快速的产前诊断。

1997年,Lo等通过男性胎儿孕妇外周血血浆Y染色体的PCR扩增法证明了孕妇循环血中存在胎儿游离DNA (cffDNA),后续的研究证实怀孕4周左右就可以从孕妇外周血中检出cffDNA,孕8周建立胎儿胎盘循环后,cffDNA以一定的比例稳定存在于母体外周血浆中。2010年,Lo等人又在Science Translational Medicine杂志发表文章,第一次证明母体外周血浆存在胎儿的全基因组信息,为无创DNA产前检测技术提供了依据。通过高通量测序技术可以对这些胎儿游离DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,最终得出胎儿患有21-三体、18-三体和13-三体综合征的风险率。

主要组成成份

试剂组分名称

规格

数量

成分及生物来源

末端修复缓冲液

360μL/管

1管

1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、1M氯化镁(MgCl2)、1M二硫苏糖醇(DTT)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)

末端修复酶

65μL/管

1管

T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase)、T4 DNA 聚合酶(T4 DNA Polymerase)、Klenow片段(Klenow Fragment)、rTaq 酶

连接缓冲液

1.45mL/管

1管

1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、1M氯化镁(MgCl2)、1M二硫苏糖醇(DTT)、腺苷三磷酸(ATP)、聚乙二醇6000(PEG6000)

连接酶

55μL/管

1管

T4 DNA 连接酶

接头(15μM)

10μL/管

1管

使用前将接头稀释至1.8μM

PCR酶混合液

1.3mL/管

1管

------

特异性引物(1-40,42-48,50)

10μL/管

1管

------

通用引物

55μL/管

1管

------

阳性质控品

50μL/管

1管

来源于21-三体、18-三体、13-三体流产组织提取打断的DNA,5%21-三体,5%18-三体,5%13-三体打断DNA、正常女性白细胞提取打断的DNA

阴性质控品

50μL/管

1管

浓度15%的人类全基因组打断DNA、正常女性白细胞提取打断的DNA

应配备以下试剂使用,并建议采用以下相关试剂:
1. 微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根公司生产,货号DP316)。
2. 无核酸酶水
3. Agencourt AMPure XP Magnetic Beads (Beckman,A63882)
4. 无水乙醇(分析纯)
5. KAPA SYBR FAST Universal QPCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS公司生产,货号KK4824)
6. 测序反应通用试剂盒(测序法)(天津诺禾致源生物信息科技有限公司)
储存条件及有效期 适用仪器
检验原理

孕周在12~24周的孕妇外周血血浆样本(怀有双胎或者多胎的孕妇不适用)。

血浆样本要求干冰条件下运输;须确保样本送达时有足够量的剩余干冰,且有缓冲装置,避免样本管在运输过程中被干冰冰块挤破。样本到达后及时存放于-20℃冰箱中;血浆样本可在-20℃存放一周;若须长期保存,须置于-80℃可保存18个月。血浆样本应避免反复冻融,样本冻融次数不超过3次。

样本处理方法如下:

1. 采血管(EDTA抗凝,Streck Cell-Free DNA BCT)采集5mL孕妇外周血,采集完毕后,轻柔颠倒采血管10次, EDTA抗凝管的外周血在生物冰袋或4℃条件下运输保存送检,须在8小时内进行血浆分离;Streck Cell-Free DNA BCT采血管的外周血常温(18~25℃)运输,须在72小时内进行血浆分离。运输过程中须采取防震装置,避免全血样本运输过程中出现大幅度摇晃。

2. 按照1600g离心10分钟,吸取上清;上清样本再经过16000g离心10分钟留取上层血浆。得到至少1.2ml血浆,立即放入-20℃或-80℃冰箱中保存,冻融次数不超过5次。应避免样本溶血,对分离好得到的血浆进行样本编号。

检验方法
1.
DNA提取
根据天根微量样品基因组DNA提取试剂盒说明书要求,通过加大反应体系(3倍反应体系),提取600μL血浆游离DNA,得42μL的DNA溶液。DNA溶液可置于-20℃保存,保存时间不超过1年,冻融次数不超过8次。
2.
文库构建

操作注意事项

1. 试剂于-20±5℃保存,使用前于2-8°C解冻,并充分混匀。反复冻融次数不超过15次。

2. 操作过程中所有反应组分应放置于冰盒内。

3. 每次反应体系都要充分混匀,并快速离心,使液体全部离心至管底。

2.1末端修复

1. 从-20℃保存的建库试剂盒中取出Buffer 1将其置于冰上融化后涡旋混匀离心,按下表配制反应体系。 2. 轻柔混匀,瞬时离心,按下表所示设置反应程序在PCR仪上进行反应,温度降至4℃后反应结束:

2.2 接头连接

1. 使用前将接头用无核酶水稀释至1.8µM,从建库试剂盒中取出Buffer 2和Adapter将其置于冰上融化后涡旋混匀离心,按下表配制反应体系。 2. 轻柔充分混匀,瞬时离心,按下表所示在PCR仪上进行反应,温度降至4℃后反应结束: 3. AMPure XP beads室温孵育30 min,按样品数准备好干净的1.5mL离心管,加入76µL(0.95×)重悬好的AMPure XP beads,并将对应的编号写好。将上一步的连接产物加入准备好的XP beads内,并涡旋混匀。室温孵育5min。 4.瞬时离心,置于磁力架上,静置2min。待溶液清亮后,用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。 5.加入200µL 80%乙醇,盖上离心管盖,上下颠倒磁力架5次,充分漂洗DNA,于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠,尽量吸净管壁和管盖上残留的乙醇)。注:80%乙醇使用无核酸酶的水配制。 6.重复上一步。 7.瞬时离心,将所有残留乙醇收集到管底,使用10µL枪头吸净离心管底部残留的液体。室温干燥5min,让乙醇尽量挥发干净。 8.加入24µL 无核酸酶水,涡旋混匀,彻底重悬磁珠,室温放置5min。 9.瞬时离心,置于磁力架上,静置2min。准备PCR管,并将编号写好。用枪头小心吸取23µL上清液到准备好的PCR管内。

2.3 PCR 扩增

1.根据样本个数,按下表比例计算PCR Master Mix和Universal Primer的用量,将其配成预混液,充分混匀,瞬间离心5秒。 2. 瞬时离心,将所有液体收集到PCR管底。按照下表所示,将上述PCR管放入PCR仪中运行扩增程序,温度降至4℃后反应结束。 反应完成后,将PCR管拿出,瞬时离心,将所有液体收集到管底,用XP磁珠进行纯化。 3. AMPure XP beads室温孵育30 min,按样品数准备好干净的1.5mL离心管,加入50µL(1×)重悬好的AMPure XP beads,并将对应的编号写好。将上一步的连接产物加入准备好的XP beads内,并涡旋混匀。室温孵育5min。 4. 瞬时离心,置于磁力架上,静置2min。待溶液清亮后,用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。 5. 加入200µL 80%乙醇,盖上离心管盖,上下颠倒磁力架5次,充分漂洗DNA,于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠,尽量吸净管壁和管盖上残留的乙醇)。注:80%乙醇使用无核酸酶的水配制。 6. 重复上一步。 7. 瞬时离心,将所有残留乙醇收集到管底,使用10µL枪头吸净离心管底部残留的液体。室温干燥5min,让乙醇尽量挥发干净。加入21µL 无核酸酶水,涡旋混匀,彻底重悬磁珠,室温放置5min。 8. 瞬时离心,置于磁力架上,静置2min,待溶液清亮后,小心吸取20µL上清至干净的离心管内,在离心管盖连接处写编号,将管盖留白以备写文库编号,作为文库原液。 9. 取1µL进行Qubit定量,记下文库浓度,写上文库编号。 10. 准备干净的500µL离心管,写好对应文库编号,取1.5µL文库按照Qubit浓度稀释至1.5ng/µL,将文库稀释液放于-20℃等待库检。
3.
文库定量

利用实时荧光PCR仪按照KAPA SYBR FAST Universal Qpcr Kit说明书对文库稀释液进行定量分析,如不立即上机测序检测的,可将纯化后文库溶液置于-20±5℃条件下保存,并在4周(28天)内上机检测。

4.
用基因测序仪(NextSeq 550 NG),按照仪器标准操作规程及上机试剂(名称)说明书操作进行检测。
5.
信息分析

运行比对及数据统计分析,获得Z值结果。

参考区间

1.本检测统计方法原始zscore(raw)、参考染色体(ir)和GC校正三种方法:

1)原始zscore(raw)检验公式如下:

  • %chrN:第N条染色体比对上reads数目占常染色体所有常染色体比对reads数目的比例;
  • :阴性对照样本集%chrN平均值;
  • :阴性对照样本集的%chrN的SD值;
  • 一般情况下,Z的绝对值小于3的概率为99.74%,被视为正常检测误差范围内,Z的绝对值大于3被视为异常,存在相应染色体三体综合征,需要进一步临床诊断确诊。

2)利用参考染色体方法进行Z检验

  • = %ChrN/;
  • :%chrN_ir计算得到的平均值;
  • :%chrN_ir计算得到的SD值;

计算方法用到的染色体如下表:

3)GC校正法:

GC校正方法使用LOESS方法。首先将基因组的所有bin按照GC含量进行分类,梯度为0.1,计算每类bin的reads数目的平均值。然后,使用局部回归的方法,对bin的reads数目平均值进行回归,得到bin reads数目随gc含量变化的回归线。根据回归线,计算相应gc含量下bin的reads数目校正需要的系数。使用Z score进行检验,所使用值均为GC校正后值
参考区间

实验有效性

阳性质控反应结果必须为阳性,且Z值>5。此反应体系结果有效。

结果判断

染色体Z值大于等于3.0的样本判定为该染色体三体阳性;

染色体Z值小于3.0判定为阴性。

建议阳性结果的受检者结合临床金标准方法染色体核型分析及其症状/体征、病史、其他实验室检查等情况综合考虑进行确诊

检验方法的局限性

1. 由于本试剂盒对平衡易位和嵌合型三体遗传异常检出率低,所以仅用于疾病的辅助诊断,不作为疾病确诊的唯一依据。对于本试剂盒检测结果,应综合患者临床诊疗及其他实验室检查手段进一步诊断;

2. 如本试剂盒检测结果与临床诊断结论出现不一致情况,建议对检验结果进行复核检测,结合临床金标准方法染色体核型分析及其症状/体征、病史、其他实验室检查等情况综合考虑,并最终以临床诊断结论为准;

3. 夫妻双方或一方存在染色体结构异常可能会导致假阳性或假阴性结果;

4. 胎盘嵌合可能会引起检测的假阳性或假阴性结果;

5. 怀有双胎或者多胎的孕妇可能会引起检测的假阳性或假阴性结果;

6. 一年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或在四周内接受过外源DNA治疗的孕妇可能会引起检测的假阳性或假阴性结果;

7. 试管婴儿可能会引起检测的假阳性或假阴性结果;

8. 体重大于100Kg的孕妇可能会引起检测的假阳性或假阴性结果。

9. 有肿瘤、病毒感染、免疫治疗的孕妇可能会引起检测的假阳性或假阴性结果。

产品性能指标

1. 阳性参考品符合率:检测企业阳性参考品,检测结果应均为对应阳性,符合率100%。

2. 阴性参考品符合率:检测企业阴性参考品,检测结果应全部为阴性,符合率100%。

3. 重复性:用精密度参考品重复测试,检测结果应均为对应阳性,且13、18、21号染色体比例变异系数CV<1%。

4. 批间差:用精密度参考品重复测试3个批号的试剂盒,检测结果应均为对应阳性,且13、18、21号染色体比例批间相对偏差R<1%。

5. 最低检出限:检出限参考品T13/T18/T21(DNA含量不大于5%,DNA总量2ng/40ul,z-score 值>3),检出结果应均为阳性。

6. 检测阳性质控品,Z值应>5。

7. 企业内控参考品列表如下:

注意事项

1. 本试剂盒仅用于体外诊断。应遵循实验室操作的相应管理规范。请在使用前仔细阅读此说明书。

2. 使用时注意:

2.1不要使用超过有效期的试剂。

2.2 不要混用不同批号和试剂盒之间的其它试剂。

2.3 -20±5℃保存试剂。

3. 操作时注意:

3.1 使用前将试剂盒及盒内所有组分应充分解冻。用过的冻存管必须仔细盖紧后保存。

3.2 所有操作时使用的与试剂组分接触的耗材均应采用DNA低吸附性材料。

3.3 为了避免潜在污染,未使用完的试剂不应该转移到原瓶。

3.4 所有操作步骤中,阳性质控的检测在一批操作中应当最后加样,以避免任何可能的污染。

3.5 一次上机测序不可有使用同样编号Adapter样本存在。

3.6 试剂盒提供试剂使用完毕,需及时盖紧试管盖,按实验室生物废料处理。

4. 安全注意事项:

4.1 根据标准实验室操作规则穿戴保护衣和一次性手套。所有被病人样本和质控污染的材料必须根据适用的规定经有效程序(高压灭菌或化学处理)灭活。

4.2 试剂可能刺激眼睛、皮肤和黏膜;一旦接触,应立即用大量清水冲洗并咨询医生。

4.3 本试剂盒内所配对照品经检测不具有传染性,但在使用时建议将其视为具有潜在传染性物质进行处理。

4.4 本试剂盒内试剂废弃物及实验过程中的废弃物应按医疗废弃物进行处理,实验废弃的PCR反应管应按照实验室相关规定进行处理以防止污染。

基本信息

生产企业名称:天津诺禾致源生物信息科技有限公司

住所:天津市武清开发区创业总部基地B08栋

联系方式:022-58717688

售后服务单位名称:天津诺禾致源生物信息科技有限公司

联系方式:022-58717688

生产地址:天津市武清开发区创业总部基地B07、B08栋

生产许可证编号: