多组学联合分析 - 疾病研究的必备策略

2017-07-11    编辑:诺禾致源

多组学联合分析

疾病研究的必备策略

基于单一组学进行疾病研究已经发现了诸多新的致病因子,但生命科学的本质远远不止于此。
疾病的发生发展是一个复杂的网络,基因变异、表观遗传的改变、基因表达水平的异常等诸多因素都会影响着生命体特征的改变。
随着测序技术和分析方法的不断完善,多组学的方法逐渐走入科学研究人员的视线,它不仅对疾病机理研究、
确定致病靶点起到推动作用,也为疾病基础科学和精准医学研究提供了新的思路。

多组学研究进展

近年来,基因组学和转录组学联合分析的方法已应用在出生缺陷[1]、髋关节骨关节炎[2]、网状色素异常[4]等研究中。下表是几篇代表文献:

表1 基因组学和转录组学联合分析代表文献

病 种 测序策略 发表时间 发表期刊 影响因子 研究内容
出生缺陷[1] WES+RNA-seq 2015 Science 37.21 基因组和转录组联合分析,以人和小鼠为对象,判断新生突变导致出生缺陷(包括先天性心脏病、神经障碍)。
髋关节骨关节炎[2] WGS+RNA-seq 2017 Nature Genetics 27.96 基因组和转录组联合分析COMPCHADL的基因型与髋关节骨关节炎患病风险之间的关系
孤立无鼻和无鼻小眼综合征[3] WGS+WES+RNA-seq 2017 Nature Genetics 27.96 基因组和转录组联合分析SMCHD1的突变与罕见肌肉萎缩相关,进而导致孤立无鼻和无鼻小眼综合征。
网状色素异常[4] WGS+RNA-seq 2016 Nature Immunology 20.00 基因组和转录组联合分析揭示POLA1基因突变引起网状色素异常的致病机理。
憩室病、憩室炎[5] WGS+RNA-seq 2017 Nature Communications 12.12 基因组和转录组联合分析ARHGAP15、COLQFAM115A的变异与憩室病、憩室炎的发生相关。
心脏功能障碍疾病[6] WGS+RNA-seq 2016 Nature Communications 12.12 基因组和转录组联合分析,以人和小鼠为研究对象,探讨与心脏功能相关的增强子,以期为心脏功能障碍疾病提供基因学上的证据。
冠状动脉粥样钙化[7] WGS+RNA-seq 2014 The American Journal of Human Genetics 10.93 整合基因组、转录组和蛋白组检测结果,表明TEREML4突变影响冠状动脉钙化。

多组学研究优势

  • 深层次挖掘候选致病因子
    整合基因组学和转录组学数据,分析疾病发生的多个连续事件,包括基因突变引起表达水平的变化,以及在转录调控、翻译、翻译后调控的各种形式的异构体和反馈调控情况。根据候选因子在不同层面的变化,锁定致病靶点。
  • 构建基因调控网络
    生物体中的基因、mRNA、调控因子、蛋白之间的相互作用构成了网状关系,为了屡清各个分子之间的调控及因果关系,需要构建基因调控网络将其互相联系起来,从而更深入的认识遗传病中复杂性状的分子机理和遗传基础。
  • 提供疾病研究的新思路
    随着科学技术的发展,单一组学已经不能够满足科研需求,多组学作为推动科学研究热点受到广泛关注,疾病研究也呈现出多组学发展的趋势。
  • 多组学联合分析
    DNA层面筛选的候选基因在转录水平的展示,RNA层面显著差异表达基因在基因组突变的情况分析,以及关键基因在通路的富集分析等联合分析内容,将基因组和转录组紧密的联系起来。

图1 基因组学&转录组学联合分析

案例分析

基因组学与转录组学联合分析揭示网状色素异常的致病机理[4]

样本选取

先天性免疫依赖于宿主对潜在抗原的特定分子模式的识别。病毒及其特定的复制模式会产生异常的核苷酸以激活先天免疫信号,引起I型干扰素产生。编码参与这些信号机制的基因发生突变会导致人类免疫缺陷疾病。X连锁的网状色素异常(X-linked reticulate pigmentary disorder, XLPDR)是一种自发炎症的原发性免疫缺乏症疾病,本研究采用全基因组测序技术,探索XLPDR遗传致病源。

技术路线

  • 样本选取
    12个XLPDR家系,4例患者样本;2例患者、4例正常人的成纤维母细胞系样本
  • 测序策略
    WGS,测序深度>50x;RNA-seq,19.5M/sample
  • 信息分析
    通过1000G/HapMap,非XLPDR疾病数据库对突变位点进行筛选,保留编码区的非同义突变和非编码区影响mRNA剪切的突变,找4例患者共有突变,发现POLA1 内含子rs24744696 A突变为G;差异表达分析发现该突变激活干扰素调节因子和NF-κB依赖的基因
  • 后期验证
    1.数据库频率验证;
    2.患病个体和正常人群验证;
    3.细胞学功能验证;
    4.qRT-PCR验证基因表达情况;
    5.蛋白表达量差异验证

研究结果

I 基因组结果:WGS发现POLA1 内含子突变

研究选取12个(5个已报道和7个新的)XLPDR家系中4例患者样本(图2),采用WGS测序分析,发现4例患病样本的POLA1 内含子区rs24744696 A突变为G。该基因编码DNA聚合酶α催化甲基,其参与合成RNA:DNA前体物。该变异与XLPDR疾病共分离,发现其他家系先证者均携带该突变,但正常人群中未检测到该突变。进一步通过细胞功能试验,发现错误剪切的POLA1 中腺嘌呤到鸟嘌呤的突变确实与XLPDR密切相关。

图2 XLPDR家系图谱

II 转录组结果:
RNA测序发现POLA1 缺陷激活I型干扰素反应机制

比较4个正常个体和2个患病个体细胞系转录组分析结果,发现患者个体细胞中许多编码I型干扰素调节因子、信号通路和NF-κB的基因表达上调(图3)。进一步对5个病人和14个正常个体血液样本进行qRT-PCR分析,发现患者个体中干扰素调节因子和NF-κB依赖的基因10倍高表达于正常个体。表明:POLA1 突变激活干扰素调节因子和NF-κB依赖基因,进而激活I型干扰素反应机制。

III 细胞功能学验证

通过免疫荧光、免疫印迹、qRT-PCR、siRNA等方法确定POLA1 内含子突变影响了DNA聚合酶α,影响细胞溶质RNA:DNA表达量,减少其杂交,进而影响抗病毒基因表达和核酸传感器通道的调节,使得I型干扰素反应机制激活,引起XLPDR疾病表型。

图3 RNA-seq分析结果

研究结论

通过多种测序策略,整合DNA和RNA分析结果,发现POLA1 内含子突变影响了POLA1 基因表达。
POLA1 缺陷影响了DNA聚合酶α,促进I型干扰素的产生。POLA1蛋白和I型干扰素共同影响RNA:DNA综合体合成,引起XLPDR疾病表型。

参考文献

[1]  Homsy J, Zaidi S, Shen Y, et al. De novo mutations in congenital heart disease with neurodevelopmental and other congenital anomalies[J]. Science, 2015, 350(6265): 1262. 阅读原文>>
[2]  Styrkarsdottir U, Helqason H, Siqurdsson A, et al. Whole-genome sequencing identifies rare genotype in COMP and CHADL associated with high risk of hip osteoarthritis[J]. Nat Genet, 2017, 49(5): 801-805. 阅读原文>>
[3]  Shaw ND, Brand H, Kupchinsky ZA, et al. SMCHD1 mutations associated with a rare muscular dystrophy can also cause isolated arhinia and Bosma arhinia microphthalmia syndrome[J]. Nat Genet, 2017, 49(2): 238-248. 阅读原文>>
[4]  Starokadomskyy P, Gemelli T, Rios J J, et al. DNA polymerase-α regulates the activation of type I interferons through cytosolic RNA: DNA synthesis.[J]. Nature Immunology, 2016, 17(5): 495. 阅读原文>>
[5]  Siqurdsson S, Alexandersson KF, Sulem P, et al. Sequence variants in ARHGAP15, COLQ and FAM155A associate with diverticular disease and diverticulitis[J]. Nat Commun, 2017, 8: 15789. 阅读原文>>
[6]  Dickel DE, Barozzi I, Zhu Y, et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 2016, 7: 12923. 阅读原文>>
[7]  Shurjo K. Sen, Kimberly C. Boelte, Jennifer J. Barb, et al. Integrative DNA, RNA, and Protein Evidence Connects TREML4 to Coronary Artery Calcification[J]. American Journal of Human Genetics, 2014, 95(1): 66. 阅读原文>>